玻璃層析柱 色層分析離子交換過濾柱

一、 原理：  有些高分子物質含有一些可以分離的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的離子產生交換反應。如：      R-SO3H＋M+ ———— R-S3M＋H+      或R-NH3OH＋CL－ ————— R-NH3CL＋OH－      這類高分子物質通稱離子交換劑，其中使用普遍的是離子交換樹脂。由于一定的離子交換劑對不同離子的親和力不同，因此在洗提過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后得到分離。  二、 目的與要求：      本實驗是采用Zerolit225型陽離子交換樹脂所裝的柱，選以特定的PH緩沖洗脫液來分離含有兩個性質不同的氨基酸溶液。通過實驗要求掌握裝柱、上樣、洗脫、收集等離子交換柱層析技術的要點。  三、儀器與裝置：      玻璃層析柱：長19cm，內徑1.2cm，3# 砂芯。      HL-2型恒流泵。      HD-4型電腦核酸蛋白檢測儀。      BS-100A自動部份收集器。      250ml燒杯。      1ml吸管。      水浴鍋。      72型（或721型）分光光度計。  四、 試劑與藥品：      樹脂：Zerolit225型陽離子交換樹脂。      洗脫液：0.45N，PH5.3檸檬酸緩沖液，取285g檸檬酸（C6O7H8•H2O）；186g 97℅NaOH；105ml濃硫酸溶于  水中稀釋至10升。      樣品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。      顯色劑：顯色劑列出兩種可任選一種。      顯色劑（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。      10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%）      顯色劑（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。      0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀釋至250ml      A、將1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）濃度的溶液。      B、將2.5ml 0.01M KCN溶液與125ml乙醇甲醚混合。將A和B合并置棕色瓶中過夜即可使用。此溶劑用時，A、B兩溶液在前一天合并，配好的溶液僅能在1-2天內使用，過時失效須重配。  五、方法與步驟：      1、樹脂的處理：      關于市售新樹脂的處理見7、，本實驗采用處理好的樹脂。      2、裝柱：將層析柱垂直裝好，關閉柱底出口，在柱內注入約1cm高的檸檬酸緩沖液。  將經處理已成鈉型的樹脂置于燒杯中，加進1倍體積的檸檬酸緩沖液，攪成懸浮狀沿柱內壁細心地把柱灌滿。倒時不要太快，以免產生泡沫。待樹脂在柱底逐漸沉積至約1cm高時，用吸管吸去柱內上層所出現的清液，慢慢打開柱底出口，繼續加注樹脂懸液直至柱體裝到8cm高度為止。  在裝柱時要避免使柱內液體流干而使裝柱失敗，另外樹脂懸浮液的溫度要相對恒定（特別是于采用高溫法）。裝好的柱體應該沒有紋路，沒有節痕，沒有氣泡，柱頂表面平整而均勻。如此，方可投入使用，否則須要重裝。      3、平衡：  柱裝好后接上調好流速的恒流泵或恒壓洗脫瓶，用檸檬酸緩沖洗脫液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的PH與洗脫液的PH相同為止，這大約需要2-3倍床體積。      4、加樣與洗脫：  移去柱上加液器塞，打開柱底出口，小心使柱內液體流至體表面時即行關閉。用加樣吸管吸取0.5ml氨基酸酸混合樣品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加樣不要過快，以免沖壞樹脂表面，加樣后慢慢打開柱底閥，使液面再與樹脂面相齊時關閉，然后再用吸管吸取適量洗脫液，如此清洗柱內壁四周2-3次。洗滌后，用緩沖液在柱內加至2-3cm高的液層，然后接上加液器，調好流速（24ml/hr）即開始洗脫。  注意在調節流速時要排除掉恒流泵或恒壓瓶與柱之間連接管內的所有氣泡。并且在調節時不要過猛，以免影響層析行為。     5、收集：柱流液可用自部分收集器約收20管。     6、測定：  將收集的各管編號后，分別取0.5ml收集液于一潔凈的干試管中，加入1ml洗脫緩沖液；0.5mlKCN茚三酮試劑，混合后在100℃水浴加熱25分鐘，然后水冷卻5-10分鐘，加3ml 60%乙醇稀釋，搖勻后用72型或721型分光光度計在570nm處比色。  測定后，以光吸收為縱坐標，收集的管數或ml數為橫坐標繪制洗脫曲線。     7、再生：  對于裝好的柱使用幾次后需要0.2N NaOH溶液洗脫，再用蒸餾水洗至中性后重復使用。  對于市售的干樹脂其處理方法為：先經水充分溶張后，傾泌去除細粒并使水澄清。然后經浮選得到顆粒大小合適的樹脂，浮先后用4倍量的2N HCL和2N NaOH依次浸洗，每次半小時，換酸或堿時要用水將樹脂洗至中性，最后樹脂應處理至溶液無黃色。這時再用1N NaOH使樹脂轉成鈉型（對于基它的轉型要視實驗和樹脂的情形而定），以蒸餾水洗至中性備用。  對于不知或難以估計層析行為的樣品層析時，要采用逐管收集測定跟蹤法，以便掌握層析的結果。  氨基酸測定一般在1PH左右，在本實驗中因緩沖液的PH就為5.3，因此可直接測定。但如果PH偏差要求太大，則可以加1ml、2N，PH5.5醋酸緩沖液，以保證測定條件。